Karsinogenezin incelenmesi ve değerlendirilmesi

Karsinojenez, çeşitli standartlaştırılmış toksikolojik testlerle incelenir. Bu testlerin ilk kısmı in vitro olarak gerçekleştirilir ve - eğer pozitiflerse - in vivo deneylerle devam ederiz. Bu deneysel adım adım yaklaşıma, denemeye nasıl devam edileceğine karar vermek için her denemenin sonunda duran bir dizi deneme olan KARAR NOKTASI YAKLAŞIMI denir. Beş aşama vardır:

FAZ A: kanserojen bileşiğin yapısı ve özellikleri;

PHASEB: Kısa süreli in vitro testlerin bu aşamasında, memeli hücreleri kullanılır. En sık kullanılan hücreler hepatositlerdir, çünkü maddenin neden olduğu hasarın şiddetine göre hepatositin geliştirdiği hasarın onarımının boyutu araştırılır. Özetle, hasarın kendi başına değil, karaciğer hücresi tarafından onarım sisteminin ne kadarının aktive edildiğini belirleriz.

Uygulanan prosedür 3 hepatosit kültürü oluşturmaktır. Birinci kültürde hepatositler sağlıklıdır, ikincisinde test maddesi ile tedavi edilirler ve son olarak üçüncü kültürde kesinlikle kanserojen olan bir kontrol maddesi ile tedavi edilirler.Bu üç kültür, bir belirteç görevi gören trityumlu timidin olan bir radyoaktif pirimidin bazı içerir.

İncelenen bileşik DNA'da bir mutasyona neden olursa, hücre bu soruna onarım sistemlerini aktive ederek yanıt verir. Mutasyona uğrayan DNA parçası kesilir ve DNApolimerazın etkisi sayesinde eksik olan parça yenisiyle değiştirilir.Düzeltme için DNApolimeraz trityumlu timidin de dahil olmak üzere yeni bazları kullanır, bir radyoaktif baz dahil edilir. Radyoaktivite analizi, tedavi edilen hücrelerdeki mutasyon seviyesini belirler: radyoaktivite ne kadar yüksek olursa, DNA mutasyonları o kadar büyük olur.

Ayrıca B fazında bakteriler üzerinde de ters mutasyon olup olmadığının çalışılabilmesi için testler yapılmaktadır. Kullanılan bakteriler, zaten mutasyon taşıyıcıları olan salmonellalardır. Mutasyon, histidin sentezi ile ilgilidir, bu nedenle salmonella, histidin olmadan büyüyemez. Bu bakteri kolonileri kısmen test maddesi, kısmen negatif kontrol ve kısmen pozitif kontrol için tedavi edilmek üzere alınır, daha sonra bilinen bir kanserojen ile test edilir. Bu test maddesi dolaylı bir genotoksik ise, kültür ortamına metabolize edici enzimler eklenmelidir. Bu noktada petri kaplarında ekilecek ve büyütülecek 3 kültür vardır (kültür besiyerinde histidin yoktur.Test edilecek kanserojen tarafından herhangi bir mutasyon yoksa teorik olarak plakalarda hiçbiri olmamalıdır. Eğer karsinojenin mutajenik bir etkisi varsa, ilk mutasyonu değiştirmiş ve bakterileri histidinsiz kültür ortamında büyütebilen ikinci bir mutasyon oluşturmuş olabilir.Bu durumda, ikinci mutasyonu modifiye ettiği ilk mutasyon ve RETROMÜTASYON adını alır Son olarak, eğer piasta petride belirgin bir büyüme olursa kanserojen doğrudandır.
Her zaman in vitro test ile kromozomal bütünlüğü belirlemek mümkündür.Bu test her zaman memeli hücreleri üzerinde yapılır ve DNA'nın biyosentezinden sorumlu bazı enzimlerde mutasyona neden olabilen toksik maddelerin test edilmesinde kullanılır.Test edilecek madde in vitro analize tabi tutulur İncelenen maddenin mevcut kromozomların bütünlüğünü ve sayısını etkileyip etkilemediğini belirleyebilmek için mikronükleus testi kullanılır. Mikroçekirdekler, içindeki kromatinin bir kısmı ile oluşturulan veziküllerdir.Bu mikroçekirdeklere dahil edilen kromatin, ya bütün kromozomlar ya da kromozom parçaları olabilir.Mikronükleiler, genetik materyali eşit olmayan yavru hücrelere yol açan yanlış hücre bölünmesiyle oluşturulur. Bu testin sonucu, klastojenik ve iğ zehirleri olarak tanımlanan maddelerin belirlenmesi olacaktır.Klastojenik madde, kromozomların asentrik fragmanları ile mikroçekirdekler üretir, böylece madde kromozomlarda bir kırılmaya neden olur, bunun yerine iğin zehirli maddesi üretir. içindeki mikronükleuslar bütün kromozomları içerir.
İncelenen madde bir veya daha fazla testte genotoksisiteye neden oluyorsa, bu durum oldukça şüpheli olarak tanımlanır, dolayısıyla doğrudan faz D'ye geçer. Öte yandan, test edilen madde herhangi bir genotoksik etki üretmiyorsa çalışma fazına geçer. C çünkü bir destekleyici olabilir.

FASEC: Bu aşamada hem in vitro hem de in vivo testler yapılabilir.

İn vitro testler için, promotör maddenin normal hücreler ve tümör hücreleri arasındaki boşluk bağlantılarını kırma ve bunun sonucunda iki hücre arasında maddelerin geçişi yapma olasılığı gösterilebilir.

Bir in vivo test, farelerde deri tümörlerinin indüklenmesidir. Test edilecek madde, farenin derisine haftada iki veya üç kez uygulanır. 2/3 ay içerisinde bu madde promotör ise papillom oluşumları olabilir. Farelerde iki ana veri göz önünde bulundurulur: papillomlardan etkilenen fare sayısı ve her hayvanda bulunan papillom sayısı. Madde bir hızlandırıcı görevi görür ve tedavi edilen farede bir tümör geliştirirse, bunun gerçekten hızlandırıcı etkisi olan bir madde olduğu anlamına gelir.

Bu testler tamamlandıktan sonra uzun süreli in vivo testlere geçiyoruz.

FASED: Bu aşamada mutajenik olduğu kanıtlanan tüm bileşikler ve mutajenik olduğu kanıtlanmayan tüm bileşikler test edilir. Yapılabilecek testler farklıdır, bazıları karaciğerde, akciğerde ve son olarak da memede yapılan testlerdir.

Karaciğer testi, yeni oluşan bir tümörün değil, neoplastik bir odağın oluşumunu, dolayısıyla tümör olmaya hazırlanan bir şeyi gösterir. Bu odağın hücreleri zaten atipik hücrelerdir, bu nedenle bir mutasyona uğramışlardır ve neoplastik hücreler olmaya hazırlanıyorlar. Belli bir süre sonra otopsi incelemesi sayesinde bu preneoplastik oluşumların sayısı ve kapsamı hesaplanarak pre-neoplastik odakların oluşumu belirlenir.

Akciğer testi, "akciğer dokusunun hücrelerinin anormalliği" olan bir adenomun belirlenmesini sağlar. Ayrıca bu durumda farenin akciğer dokusu oldukça uzun bir süre (aylar) sonra incelenir (bu adenomlar kolayca tanımlanabilir çünkü pulmoner epitelde beyazımsı nodüllerdir).
Meme testi, glandüler dokudaki tümörlerin belirlenmesini sağlar. Oluşan adenom sayısı ve adenom gösteren hayvan sayısı her zaman değerlendirilir.

Bu testlerden olumlu sonuçlar alınırsa, test maddesi gerçekten kanserojendir. Bu noktada çok uzun yürütme süreleri olan pahalı testler yapmaya geçiyoruz.

FAZI: Bu aşamada, 20'den 50'ye kadar değişen sayıda hayvan, uzun süreli testlere tabi tutulur.Bu testler çok pahalıdır ve kesin sonuçların elde edilmesi uzun zaman alır; hayvanın ömrünün yaklaşık 1/8'inden bahsediyoruz.Bu testler sırasında bazı hayvanların ölmesi mümkündür, ancak bunlar her zaman bir otopsi ve histolojik tip incelemesi ile incelenir. Seçilen hayvanlar her zaman sıçanlar ve farelerdir ve uzun süreli testlerin sonuna kadar sadece %70-80'i hayatta kalır. Kullanılan hayvanlar daha yeni sütten kesiliyor, ne kadar küçüklerse tedavilere o kadar duyarlı oluyorlar. Uzun süreli test süresi boyunca, araştırmacı her zaman toplanan tüm bilgileri dikkate alabilen ve çeşitli verileri yeniden üretebilen bir matematikçi-istatistikçi tarafından desteklenir.

Hayvanlar üzerinde test edilen dozlar, tolere edilen maksimum dozdan ve tüm alt katlarından başlar ve hayvandaki doz-yanıt reaksiyonu değerlendirilir.
Uygulama her zaman erkeğin incelenen madde ile temas edebileceği yola, dolayısıyla ağızdan, deriden veya solunum yoluna yaklaşmalıdır, ancak bir ilacın kanserojenliği test edilirse intravenöz uygulamanın yapılması da yararlıdır.
Test edilen hayvan grupları 4'tür (her grup için 50 hayvan):

Tedavisi olmayan bir NAIF grubu;
Araçla tedavi edilen bir grup;
Test maddesi ile tedavi edilen bir grup;
Bilinen bir kanserojen ile tedavi edilen bir grup.

Her gruptaki hayvan sayısının mümkün olduğunca eşit olması çok önemlidir.Aslında hayvan sayısında çok fazla fark varsa istatistiksel testin sahte olduğu ortaya çıkabilir.
Yapılan değerlendirmeler şunlardır:

Tümörlerin toplam sıklığı;
Bazı tümörlerin sıklığı;
Birden fazla tümör tipine sahip hayvanların sıklığı;
Hayvan kanserlerinin sayısı.

Tüm bu çalışma aşamalarının sonunda, madde, IARC (Uluslararası Kanser Araştırma ve Geliştirme Ajansı) ve Çevre Koruma Ajansı (EPA) tarafından oluşturulan bir sıralamada sınıflandırılır.